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流式细胞凋亡检测服务Technical service

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流式细胞凋亡检测服务

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实验步骤

一、收集细胞

收集细胞{数目约(1~ 5)×106个/mL},500~ 1 000 r/min离心5 min,弃去培养液。

 
二、细胞洗涤
3 ml PBS洗涤1次。
 
三、乙醇固定
离心去PBS,加入冰预冷的70%的乙醇固定,4℃,1-2小时。
 
四、细胞重悬
离心弃去固定液,3 mlPBS重悬5 min。
 
五、细胞过滤
400目的筛网过滤1次,500-1000 r/min离心5 min,弃去PBS。
 
六、染色
用1 ml PI染液染色,4℃避光30 min。
 
七、流式细胞仪检测
PI用氩离子激发荧光,激光光波波长为488 nm,发射光波波长大于630 nm,产生红色荧光分析PI荧光强度的直方图也可分析前散射光对侧散射光的散点图。
 
八、结果判断
在前散射光对侧散射光的散点图或地形图上,凋亡细胞与正常细胞相比,前散射光降低,而侧散射光可高可低,与细胞的类型有关;在分析PI荧光的直方图时,先用门技术排除成双或聚集的细胞以及发微弱荧光的细胞碎片,在PI荧光的直方图上,凋亡细胞在G1/G0期前出现一亚二倍体峰。如以G1/G0期所在位置的荧光强度为1.0,则一个典型的凋亡细胞样本其亚二倍体峰的荧光强度为0.45,可用鸡和鲑鱼的红细胞的PI荧光强度做参照标准,两者分别为0.35和0.7,可以确保在两者之间的不是细胞碎片而是完整的细胞。
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