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划痕实验检测Technical service

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划痕实验检测

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 一、实验概述

细胞划痕实验(Wound Healing)是一种操作简单,经济实惠的研究细胞迁移/肿瘤侵袭的体外试验方法。这种方法的原理是,当细胞长到融合成单层状态时,在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域,称为“划痕”,划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合,在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程,是研究细胞迁移的体外实验中最简单的方法。

划痕实验中,检测目标为感染病毒后表达荧光蛋白的目的细胞[不表达荧光蛋白也可以,但是图片得视觉效果不如表达荧光蛋白(生长于96孔板中)。用专用的划痕工具制造划痕,细胞成像系统识别带绿色荧光的细胞并拍照(即读板)。然后通过软件对同一视野细胞迁移0hx hx为实验细胞合适的迁移时间点[时间太早,划痕愈合的效果不明显,时间太长,不同组别的划痕都愈合完成,组间看不到差异,推荐时间点为0h8h16h24h36h48h] )后图像进行分析处理,计算出实验细胞在x h的迁移面积。

 

二、实验材料

1.主要试剂

胎牛血清、基础培养基、胰酶、PBS

2. 主要仪器

生物安全柜、荧光显微镜、离心机、CO2培养箱

三、实验步骤

1   将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后,完全培养基重悬成细胞悬液,计数;

2   根据细胞大小决定铺板细胞密度(大多数细胞铺板数设定为50000 cell/well),以次日细胞达到90%以上汇合度为准[细胞铺的太多,太挤,连原本细胞形态都会看不清。划的时候,也很容易划不干净,而且划完以后,两边会挂有一团团细胞,使两边边界不清晰。不同细胞,形态大小不一,铺板细胞量自然也就不一样,想要找出铺板最佳细胞量,最快捷的方法就是铺梯度。96孔板,那么多孔,足够一次铺好几个密度梯度了(3万,5万,10万,随便试37℃、5%CO2培养箱培养,每组3复孔,培养体系为100 μL/孔。

3   第二天换低浓度血清培养基,使用1ml枪头垂直对准96孔板的下端中央部位,向上轻推形成划痕[人工枪头制造划痕难以保证划痕宽度的一致性,影响实验结果,这也是该方法最大的缺陷建议使用专用的划痕仪

4   使用PBS轻轻漂洗2-3[划完以后,痕中间和培养液中遗落少量细胞,是可以通过清洗去除的(如果太多,就别挣扎了,重新再来吧),有些是已经被划动了,但没有完全划掉,这时候清洗个两三次,清洗的时候轻拍96孔板,已经被划动的贴壁不牢的细胞大多数会别洗掉。不过,对于一些本身就容易脱落的细胞,就不能这样洗了,只能“温柔以待”,以免细胞全被洗没了 ,加入低浓度血清培养基(如1% FBS)使用低浓度的培养基是为了防止细胞增殖对划痕结果的影响0 h拍照。

5   37℃、5% CO2培养箱培养,根据愈合程度选择合适时间用细胞成像设备扫板。

6   分析迁移面积。

四、划痕数据分析概述

迁移面积=x h的细胞面积-0 h的细胞面积。

3   计算迁移面积=S3+S4-S1+S2


4   针对划痕预实验,根据迁移面积,判断细胞是否有愈合能力;针对划痕实验,根据

(上图检测目标为感染病毒后表达荧光蛋白的目的细胞举例)

 

试验时间:7个工作日



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