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Transwell法检测

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迁移实验(cell migration assay) 实验介绍 细胞迁移与侵袭实验将 Transwell 小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层 培养液中的成分可以影响到上室内的细胞, 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

 

1 材料准备: 可拍照显微镜,Transwell 小室,孔径 8μmTranswell 迁移实验的细胞培养板 24 孔板。细胞培养板应当与购买的 Transwell 小室相配套,无血清 DMEM(1%胎牛血清)DMEM 1640 培养基, DMEM 完全培养基,1640 完全培养基(也可加到 20%血清) ,无菌 PBS,棉签,胰酶,4%多聚甲 醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0.1%g/mlPBS 结晶紫)

2 步骤和流程

消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,用 PBS 12 遍,用无血清培养基重悬。调整细胞密度至 5×105/ml

接种细胞 ①取细胞悬液 100ml加入 Transwell 小室。 ②24 孔板下室一般加入 600ml 20%FBS 的培养基,特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候 要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。 ③培养细胞:常规培养 1248h(主要依癌细胞侵袭能力而定) 。24h 较常见,时间点的选 择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。

结果统计

直接计数法,“贴壁”细胞计数,这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室 侧而不会掉到下室里面去,通过给细胞染色,可在镜下计数细胞。取出 Transwell 小室,弃去孔中培养液,用无钙的 PBS 2 遍,甲醇固定 30 分钟将小室适当风干。0.1%结晶紫染色 20 min,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,用 PBS 3 遍。40倍显微镜下随即五个视野观察细胞,记数。

试验时间:7个工作日



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